人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的观者或在不同的时间去看，感受似乎都不同。有时觉得她笑得舒畅温柔，有时又显得严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至显出讥嘲和揶揄。在一幅画中，光线的变化不能像在雕塑中产生那样大的差别。但在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影时隐时现，为她的双眼与唇部披上了一层面纱。而人的笑容主要表现在眼角和嘴角上，达·芬奇却偏把这些部位画得若隐若现，没有明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。 《蒙娜丽莎》这幅名画，又称为“微笑”。画中的蒙娜丽莎却是确有其人。她是佛罗伦萨一位富有的女市民。达芬奇刚开始为她画像时，她年仅二十四岁。据说，在此前不久，蒙娜丽莎心爱的女儿刚刚夭折，因此她整天闷闷不乐。为了唤起模特儿发自内心的微笑，画家一边为她画像，一边请人在她身边奏乐，如此这般千方百计引出了这位美人的一刹那的微笑，仿佛稍纵即逝。你看：蒙娜丽莎嘴角微皱，眉宇舒展，脸部则显示出了刚可察觉的微笑。这微笑似乎是从脸上掠过似的，既显示了她内心的激动，又没有失去安详的表情，显露了人物内心深处微妙的心理活动，引人遐想，令人神往。

蒙娜丽莎的微笑，有时候让你觉得温文尔雅令人陶醉；有时仿佛内涵哀愁似显凄楚；有时候又略呈讽刺之状，虽则美丽动人却又有点不可接近。自从《蒙娜丽莎》问世几百年来，人们在她面前品味着，揣测着，争辩着，神秘莫测，令人百思不得其解。

当然，讨论蒙娜丽莎的笑容，关系创作者的艺术思想以及表现手法上。这个问题的探讨决不同于中世纪经院哲学家争论一枚针尖上可以站几个天使那样无聊。学者们是认真地探讨蒙娜丽莎微笑神秘莫测的原因的。

有的人从审美心理学的观点出发认为，同一件艺术品，不同的人或同一个人在不同的心境下观赏，往往会有不同的感受。人们凭借自己的生活经验，能从中不断发现作品的新含义。

有的学者如美术史家詹姆森，从美学角度指出，这种神秘微笑的造成是因为作者力图要在一个个形非常具体的人物身上，创造出他理想化了的美的典型；力图要是一闪即逝的面部表情，成为一种喜悦的永恒的象征。正是这种矛盾的结合产生出了令人觉得出奇的客观效果。

有的则从历史学家的眼光做出分析，说达芬奇笔下的蒙娜丽莎的微笑，显示了早期资产阶级的勃勃生机，对资本主义的明天充满了希望，她正是新兴资产阶级的真实写照。

有的画家则从绘画技巧上进行探讨，说达芬奇为这个坐在阳台上的少妇，设置了一幅透视不一的背景，当人们的视线集中在左边，感到远景下降而人物上升；反之，当人们集中到右边看时，感到远景上升而人物下降。画像中的人物五官，其位置亦在游弋不定之中。加上作者把体现人的笑容的嘴角岩脚部位，又画得若隐若现，界限不甚分明，这就使得画中主人公的微笑颇费猜疑。